Gerade hat das Team des Nobelpreisträgers David Baker erneut in Science publiziert: Das Proteindesign wurde auf die präzise atomare Ebene gehoben.

Welche Möglichkeiten würden sich für die Umweltbehandlung und die Biomedizin ergeben, wenn man ein Enzym nach Bedarf konstruieren könnte, das speziell giftige Schadstoffe abbaut, oder eine Protease erzeugen könnte, die gezielt krankheitsbezogene spezifische Peptidsegmente schneidet?

Seit langem verlassen sich Wissenschaftler hauptsächlich auf die Suche und Modifikation natürlicher Proteine, um diese Ziele zu erreichen. Die Neukonstruktion eines Enzyms mit echter katalytischer Aktivität ist weit schwieriger als die Gestaltung seiner dreidimensionalen Struktur: Zahlreiche Schlüsselatome müssen im Raum exakt zusammenwirken, um die erwartete chemische Reaktion durchzuführen.

Zuvor hat das Team von David Baker, Nobelpreisträger für Chemie, Pionier auf dem Gebiet des künstlichen Proteindesigns und bekannt als „Hand Gottes“, bereits mit Rechenmethoden verschiedene künstliche Enzyme wie Serinhydrolasen und Metallhydrolasen entworfen. Bei komplexen Reaktionen, die mehrere katalytische Reste, Metallionen und sogar nicht proteinogene Komponenten einbeziehen, ist die genaue Steuerung der Anordnung dieser Atome und die effiziente Generierung entsprechender Molekülstrukturen jedoch nach wie vor ein großes Problem im Bereich des Proteindesigns.

Heute veröffentlicht das Baker-Team eine neue Studie in „Science“: Mit dem generativen KI-Modell RFdiffusion3 (RFD3) durchbricht es die bisherigen Gestaltungsbeschränkungen für funktionelle Stellen komplexer Biomoleküle und erzielt zwei wichtige experimentelle Ergebnisse: künstliche Enzyme, die giftige organische Phosphorverbindungen hydrolysieren können, sowie Proteasen, die spezifische Peptidsegmente selektiv schneiden.

Darüber hinaus übertrifft RFD3 in mehreren Rechentests frühere Methoden und erweitert die atomare Gestaltungsfähigkeit auf RNA sowie gemischte Protein-Nukleinsäure-Systeme.

Link zur Arbeit: http://www.science.org/doi/10.1126/science.aeh2982

Die Forscher gehen davon aus, dass diese Methode in Zukunft auf breitere Aufgaben im Biomoleküldesign angewendet werden kann.

I. Wie erweitert RFD3 die Fähigkeiten des KI-gestützten Designs?

Im Jahr 2023 erschien das von Bakers Team entwickelte RFdiffusion in Nature und ermöglichte die de novo-Generierung verschiedener neuartiger Proteinstrukturen. RFdiffusion2 erweiterte die Gestaltungsfähigkeit weiter auf die aktiven Zentren von Enzymen, sodass Forscher das Proteinrückgrat anhand der räumlichen Position weniger wichtiger katalytischer Atome aufbauen können.

Eine vernünftige Gesamtstruktur des Proteins bedeutet jedoch nicht, dass es unbedingt die erwartete Funktion erfüllen kann. Komplexe enzymatische katalytische Reaktionen erfordern oft das genaue Zusammenspiel mehrerer Aminosäureseitenketten, Metallionen und kleiner Substratmoleküle. Selbst RFD2, das Schlüsselatome als Gestaltungsbedingung nutzen kann, führt seinen Diffusionsprozess hauptsächlich auf Ebene der Reste durch und ist schwer in der Lage, gleichzeitig die feinen Wechselwirkungen zwischen mehr Seitenketten, Liganden und katalytischen Resten aufzubauen.

Um diese Einschränkung zu beheben, hat das Forschungsteam RFD3 mit einer einheitlichen Architektur für die Generierung aller Atome entwickelt.

Im Gegensatz zu früheren Gestaltungsmethoden, die hauptsächlich auf Aminosäurereste als Einheit basieren, integriert RFD3 die Atome im Proteinrückgrat, in den Seitenketten und in Nukleinsäuren in ein einheitliches Modellierungsframework. Forscher können direkt die räumliche Position von Schlüsselatomen, Wasserstoffbrückenbindungen, die Ausrichtung des Substrats und den Grad der Atombegrabung festlegen, und das Modell generiert dann das Molekülgerüst, das diese Bedingungen erfüllt, ohne dass die genaue Position der katalytischen Reste in der Proteinsequenz im Voraus festgelegt werden muss.

Abbildung｜Der allatomare Diffusionsgenerierungsprozess von RFdiffusion3 und Beispiele für Biomoleküldesign unter verschiedenen Bedingungen

Mit anderen Worten: Forscher können zuerst festlegen, welche Atomanordnung zur Erfüllung einer bestimmten Funktion erforderlich ist, und dann die KI eine geeignete Molekülstruktur finden lassen.

Rechentests zeigen, dass RFD3 sowohl in Bezug auf Präzision als auch Effizienz verbessert ist: Bei 41 Gestaltungsaufgaben für Enzymaktivzentren übertreffen 37 das Vorgängermodell RFD2; für Proteine typischer Länge ist seine Generierungsgeschwindigkeit mehr als doppelt so hoch wie bei RFD1 und BoltzGen.

Die Gestaltungsobjekte von RFD3 sind nicht mehr auf Proteine beschränkt. Bei 57 Tests zum RNA-Strukturdesign erreichen 21 den Standard einer Strukturübereinstimmung mit einem LDDT-Wert von über 0,9, während es beim Vergleichsmodell RFDpoly nur 10 sind. Das Forschungsteam zeigte zudem die Fähigkeit zum rechnergestützten Design von RNA-Aptameren und gemischten katalytischen RNA-Protein-Strukturen.

RFD3 wurde bereits 2025 in Form eines Preprints veröffentlicht. Die aktuelle Science-Studie schlägt nicht erstmals eine allatomare Gestaltungsmethode vor, sondern zeigt vielmehr ihre Anwendbarkeit in komplexen katalytischen Zentren und verschiedenen Biomolekülsystemen und validiert durch echte Experimente die anspruchsvolleren Ergebnisse beim Design künstlicher Enzyme.

II. Vom Schadstoffabbau bis zur Krankheitsforschung

Das wichtigste experimentelle Ergebnis dieser Studie ist die de novo-Konstruktion von zwei Arten künstlicher Enzyme mit katalytischer Aktivität.

Erstens: Eine Phosphotriesterase, die organische Phosphorverbindungen hydrolysieren kann.

Organische Phosphorverbindungen werden weit verbreitet in Produkten wie Pestiziden und Flammschutzmitteln verwendet, einige von ihnen sind hochgiftig und schwer abbaubar. Enzyme, die diese Verbindungen hydrolysieren können, haben potenziellen Wert in der Umweltsanierung und medizinischen Gegenmaßnahmen. Die aktiven Zentren natürlicher Phosphotriesterase umfassen jedoch 6 katalytische Reste, zwei Metallionen und eine spezielle Lysinmodifikation, sodass ihre komplexen räumlichen Beschränkungen eine de novo-Konstruktion erschweren.

Das Forschungsteam verwendete Paraoxon als Modellsubstrat, erstellte mit Hilfe der Quantenchemie ein Übergangszustandsmodell der katalytischen Reaktion, generierte dann das Proteinrückgrat über RFD3 und kombinierte dies mit Werkzeugen wie LigandMPNN und AlphaFold3 für das Sequenzdesign und die Strukturselektion.

Von den ersten 96 Kandidatenkonstruktionen zeigten 4 katalytische Aktivität. Das aktivste davon, ZAPP-1, kann mehrere Katalysezyklen durchführen, seine katalytische Geschwindigkeitskonstante kcat beträgt 0,015 ± 0,003 s⁻¹. Die Forscher validierten durch weitere Experimente wie die Anpassung der Bedingungen für die Carbamoylierung von Lysin und die Mutation wichtiger katalytischer Reste den Zusammenhang zwischen dem entworfenen aktiven Zentrum und der tatsächlichen katalytischen Reaktion.

Abbildung｜Aktives Zentrum der von RFD3 entworfenen Phosphotriesterase und Molekülstruktur von ZAPP-1

In einem zweiten Experiment erhielt das Team weitere aktive Enzyme aus 192 Konstruktionen, wobei die charakterisierten hervorragenden Entwürfe 4 verschiedene Proteinrückgrate abdecken. Die katalytische Reaktionsgeschwindigkeit von ZAPP-2 ist gegenüber der nicht katalysierten Bedingung um etwa 500.000-fach erhöht.

Dies zeigt, dass RFD3 nicht nur aktive Enzyme für komplexe chemische Reaktionen entwerfen kann, sondern auch verschiedene Strukturlösungen finden kann, was neue Möglichkeiten für die Entwicklung von Biokatalysatoren für bestimmte chemische Substanzen bietet.

Ein weiteres Experiment konzentriert sich auf das mit Amyloidose-Erkrankungen verbundene Transthyretin (TTR).

Die fehlerhafte Faltung und Aggregation von TTR kann Organe wie Herz, Nervensystem und Nieren schädigen. Die Forscher nutzten RFD3, um künstliche Proteasen zu entwerfen, die spezifische Peptidsequenzen aus TTR erkennen und schneiden können.

Von 96 Kandidatenkonstruktionen überschritten 56 die Schneidrate von 10 % in cis-Experimenten. TTRg11 kann den Großteil des Ziel-Reportersubstrats innerhalb von 1 Stunde schneiden, und Massenspektrometrie bestätigte, dass der Schnitt an der vorgesehenen Position stattfindet.

Abbildung｜Molekülstruktur und aktives Zentrum der künstlichen Protease TTRg11

Im Vergleich zu Peptiden aus 6 weiteren krankheitsbezogenen Proteinen weist TTRg11 eine deutlich höhere Aktivität gegenüber dem Zielsubstrat auf. Ohne experimentelle Optimierung erreicht seine katalytische Effizienz kcat/KM 1100 ± 300 M⁻¹ s⁻¹, was im unteren Bereich des Effizienzbereichs einiger natürlicher Proteasen liegt (natürliche Enzyme liegen meist im Bereich von 10⁴–10⁸).

Dieses Ergebnis zeigt das Potenzial für das Design künstlicher Proteasen nach vorgegebenen Substraten, beweist aber noch nicht, dass es TTR-Amyloidablagerungen im menschlichen Körper beseitigen kann, und bedeutet noch lange nicht, dass ein therapeutisches Arzneimittel erhalten wurde.

Aus Sicht der Anwendungsperspektive kann das präzise Design künstlicher Enzyme den Bereich der Reaktionen erweitern, die von industriellen Biokatalysatoren verarbeitet werden können, und neue Werkzeuge für den Abbau spezifischer Schadstoffe bereitstellen; künstliche Proteine mit Fähigkeiten zur Zielerkennung und zum Schneiden können für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen, molekulare Nachweismethoden und die Entwicklung potenzieller therapeutischer Strategien verwendet werden. Die Unterstützung von RFD3 für RNA und gemischte Protein-Nukleinsäure-Systeme bietet zudem einen neuen Weg für das Design funktioneller Moleküle wie RNA-Aptamere und Ribozyme.

Vom Erhalt aktiver Enzyme im Labor bis zur praktischen Anwendung müssen jedoch noch katalytische Effizienz, Stabilität und Sicherheit weiter verbessert werden. Einige Ergebnisse des RNA-Designs beruhen derzeit hauptsächlich auf rechnergestützten Vorhersagen und erfordern noch weitere experimentelle Validierungen.

Von der Vorhersage von Proteinstrukturen durch AlphaFold über die Generierung neuartiger Proteine durch RFdiffusion bis hin zur präzisen Gestaltung komplexer katalytischer Zentren durch RFD3 erweitert die KI schrittweise die Fähigkeiten im Biomoleküldesign.

Weitere technische Details finden Sie in der Originalarbeit.

Dieser Artikel stammt aus dem WeChat-Offiziellen Konto „Academic Headline“ (ID: SciTouTiao), Autor: ZHANG Jiayi, veröffentlicht mit Genehmigung von 36Kr.