Gerade hat die Nobelpreisträgerin Doudna erneut in Science veröffentlicht: KI-gestütztes Design von Proteinen übertrifft die natürliche Evolution

Das Team des Nobelpreisträgers Jennifer Doudna veröffentlicht erneut eine bahnbrechende Arbeit in der Top-Zeitschrift Science.

Sie haben eine KI-Protein-Design-Methode erreicht, die „die natürliche Evolution übertrifft“. Die neu geschaffenen, gentechnisch veränderten Proteine SynTnpB zeigen bei einigen Varianten eine Aktivität, die sogar die der natürlichen Enzyme erreicht oder übersteigt.

Link zur Arbeit: http://www.science.org/doi/10.1126/science.aed6123

Die Kryo-Elektronenmikroskopie-Ergebnisse zeigen weiter, dass diese gentechnisch veränderten Proteine in verschiedenen Konformationen neue stabile Wechselwirkungen an der RNA-DNA-Grenzfläche bilden. Dies ist auch das erste Mal, dass die Struktur einer KI-entworfenen RNA-gesteuerten Nuklease experimentell bestimmt wurde.

Das Forschungsteam erklärt, dass durch die Kombination von generativer Biologie und De-novo-Designverfahren in Zukunft die Grenzen natürlicher Sequenzen durchbrochen und die Funktionen sowie der Gestaltungsraum dieser Proteine erweitert werden können.

KI-Protein-Design über die Natur hinaus

Derzeit kann die CRISPR-Cas-Technologie DNA/RNA präzise bearbeiten, aber es ist keineswegs einfach, RNA-gesteuerte Nukleasen zu entwerfen, die in der Natur nicht existieren und dennoch aktiv sind. Die von vorhandenen Sequenzmodellen erzeugten Enzyme ähneln oft natürlichen Sequenzen; obwohl strukturgeführtes Design einen größeren Sequenzraum erkunden kann, ist es schwierig, die Aktivität zu erhalten, während die Sequenz stark verändert wird.

Im Gegensatz zu früheren sequenzbasierten biologischen Sprachmodellen schlägt das Doudna-Team eine KI-Protein-Designstrategie vor, die Struktur- und Evolutionsinformationen kombiniert, um RNA-gesteuerte Nukleasen mit stark differenzierten Sequenzen, aber erhaltener Aktivität zu erzeugen.

Um diese Strategie zu überprüfen, wählten sie die kleine RNA-gesteuerte Nuklease TnpB als Designobjekt aus. Der genaue Ablauf ist wie folgt:

1. Designmodul: Generieren neuer TnpB-Sequenzen

Sie verwendeten zunächst das ESM-Inverse-Folding-Modell (ESM-IF1), um Kandidatensequenzen basierend auf der dreidimensionalen Struktur von TnpB zu erzeugen. Die von der KI erzeugten Sequenzen können die gesamte Faltung von TnpB und die DED-katalytische Triade der RuvC-Domäne erhalten, aber sie verändern auch einige RNA/DNA-Erkennungsreste.

Um dieses Problem zu lösen, konstruierten sie Sequenzmasken basierend auf Evolutionsinformationen: Reste, deren Positions-Konservativität (Ci) oder deren koevolutionäre Kopplungsstärke (σi) mit Nukleinsäuresequenzen über einem festgelegten Schwellenwert liegen, werden als Wildtyp fixiert, während die übrigen Positionen von ESM-IF1 neu gestaltet werden.

Abbildung | Strategie zur Gestaltung der RNA-gesteuerten Nuklease TnpB unter Verwendung des ESM-Inverse-Folding-Modells (ESM-IF1).

2. Screening-Modul: Identifizieren von Varianten mit Aktivität

Nach Abschluss des Sequenzdesigns screeneten sie aktive Varianten mit dem bakteriellen ccdB-Toxinsystem: TnpB-Varianten, die das Plasmid mit dem Toxin schneiden können, ermöglichen das Überleben der Bakterien. Da die Aktivität der vollständigen Sequenz, die nur durch Ci beschränkt ist, begrenzt war, teilten sie die beiden Domänen von TnpB zur separaten Prüfung auf: Die REC-Domäne ist hauptsächlich an der DNA-Erkennung beteiligt, die NUC-Domäne ist mit der RNA-Bindung und Katalyse verbunden. Die Ergebnisse zeigten, dass die NUC-Domäne sequenzielle Veränderungen besser toleriert. Auf dieser Grundlage verwendeten sie die kombinierte Ci/σi-Bedingungsbeschränkung, um 9 hochaktive und hochdiverse Varianten aus 1980 REC-NUC-Kombinationen zu screenen.

Abbildung | Screening der KI-generierten Variante SynTnpB, die durch Schwellenwerte für Positions-Konservativität (Ci) und Kopplungsstärke (σi) bedingt ist.

Aktivität, die natürliche Enzyme übertrifft

Insgesamt behalten die KI-entworfenen SynTnpB-Varianten ihre Aktivität in Bakterien-, Pflanzen- und menschlichen Zellen bei und übertreffen sogar die natürlichen Enzyme. Die Kryo-Elektronenmikroskopie-Strukturen zeigen weiter, dass diese KI-entworfenen Varianten die RNA-DNA-Grenzfläche in verschiedenen Konformationszuständen stabilisieren können. Die genauen Ergebnisse sind wie folgt:

1. Bearbeitung menschlicher und pflanzlicher Zellen

Die gescreenten Varianten behalten in menschlichen und pflanzlichen Zellen ihre Bearbeitungsaktivität bei, wobei einige die natürlichen Enzyme übertreffen. Sie platzierten 9 Varianten in HEK293T-Zellen und Arabidopsis-Thaliana-Protoplasten zur Überprüfung. In menschlichen Zellen ist die Aktivität der meisten Varianten mit der des Wildtyps vergleichbar, wobei v1 und v5 die besten Ergebnisse zeigen und eine maximale Bearbeitungsrate von 50 % erreichen, was etwa dem 1,8-fachen des Wildtyps entspricht. In Experimenten mit pflanzlichen Zellen übertraf v1 den Wildtyp ebenfalls bei den meisten getesteten Zielsequenzen.

Abbildung | KI-generierte TnpB-Genombearbeitung in HEK293T-Zellen.

2. Spezifität und biochemische Charakterisierung

In Bezug auf die Spezifität behalten die SynTnpB-Varianten die typische TTGAT-TAM-Präferenz von TnpB bei, aber die Off-Target-Leistung variiert je nach Variante. Die genomweite Tn5-Tag-Analyse zeigte, dass die Spezifität von v1 mit der des Wildtyps vergleichbar ist, während bei v5 und v7 mehr Off-Target-Stellen nachgewiesen wurden.

In Bezug auf Expression und biochemische Charakterisierung können die Unterschiede in der Bearbeitungsaktivität nicht einfach auf das Expressionsniveau zurückgeführt werden. Die Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass das Expressionsniveau der einzelnen Varianten nicht mit der Bearbeitungsaktivität korreliert. Am Beispiel der Variante v7 ist ihre thermische Stabilität mit der des Wildtyps vergleichbar, und sie behält eine starke Aktivität zum Schneiden der Zielkette bei, obwohl die Schneidereaktion im Vergleich zum Wildtyp etwas verlangsamt ist.

3. Kryo-Elektronenmikroskopie-Struktur

Die Ergebnisse zeigten, dass die von der KI erzeugten Reste in mehreren Domänen neue Kontakte mit der RNA-DNA bilden und die Grenzfläche in verschiedenen Konformationszuständen stabilisieren. Darüber hinaus fingen sie einen intermediären Zustand der TAM-Bindungskonformation ein, der zuvor bei TnpB nicht beschrieben wurde.

Sie wählten die Sequenz mit hohem Sequenzdifferenzierungsgrad, v7, für die Kryo-Elektronenmikroskopie-Analyse aus. Die Sequenzidentität dieser Variante zum Wildtyp beträgt 77 %, und sie zeigt eine hohe Bearbeitungseffizienz am RUNX1-Ort. Die Experimente zeigten, dass die Auflösung der Kryo-Elektronenmikroskopie-Struktur 2,8 Å erreicht und zwei Konformationen erfasst: den TAM-Bindungszustand und den R-Loop-Bildungszustand.

Im TAM-Bindungszustand ähneln die Konformationen von Protein und RNA dem binären Komplex von ISDra2 TnpB, binden gleichzeitig DNA und bilden eine einzelne Basenpaarung in der Samenregion des Heteroduplex. Der KI-generierte Rest N4R stabilisiert diese Paarung zusammen mit dem konservierten „Phosphat-Schloss“-Rest K84. Dieser Konformationszwischenzustand wurde zuvor bei TnpB nicht beobachtet.

Im R-Loop-Bildungszustand haben reRNA und Ziel-DNA bereits eine relativ vollständige Paarungsstruktur gebildet. Zu diesem Zeitpunkt sind die KI-generierten Reste in Bereichen wie REC, NUC und Lid verteilt und bilden Kontakte mit diesem RNA-DNA-Doppelstrang; gleichzeitig behält die Brückenhelix die Biegebewegung bei, die zur Bildung des Doppelstrangs beiträgt.

Abbildung | Die Kryo-Elektronenmikroskopie-Struktur der KI-generierten Variante v7 zeigt die Reste an der RNA-DNA-Grenzfläche und die konservierte Konformationsbewegung.

Mängel und zukünftige Entwicklungen

Sie weisen jedoch auch darauf hin, dass die aktuelle Methode zwar auf mehr RNA-gesteuerte Nukleasen und andere dynamische Nukleinsäure-bindende Proteine ausgeweitet werden kann, es aber einige Mängel gibt.

Beispielsweise ist in Bezug auf das Designziel die Toleranz der verschiedenen TnpB-Domänen gegenüber Sequenzänderungen nicht gleich: Die mit der DNA-Erkennung verbundene REC-Domäne ist empfindlicher gegenüber Substitutionen, während die mit der RNA-Bindung und Katalyse verbundene NUC-Domäne Veränderungen besser toleriert. In Zukunft müssen sie noch weiter prüfen, ob die Prinzipien des modularen Designs auch auf andere Multidomänen-Proteine anwendbar sind.

Gleichzeitig hängen die Sequenzmasken in Bezug auf die Datenbedingungen von ausreichend reichhaltigen Evolutionsinformationen ab, was hohe Anforderungen an die Diversität und Repräsentativität der Sequenzen in der Datenbank stellt. Reichhaltigere und ausgewogenere Protein-Nukleinsäure-Paarungsdaten werden dazu beitragen, diese Methode auf andere Mehrzustands-Proteine oder Nukleinsäure-bindende Proteine auszuweiten.

Darüber hinaus muss in Bezug auf das Mechanismusverständnis weiter untersucht werden, wie KI-generierte Reste die Nukleinsäurebindung und Konformationsänderungen beeinflussen. Sie erklärten, dass die Kryo-Elektronenmikroskopie-Strukturen dieser Arbeit einen zuvor nicht beschriebenen TAM-Bindungszustand erfassen, der einen kinetischen Zwischenzustand darstellen könnte und ein Beispiel für zukünftige Untersuchungen der kurzlebigen Konformationen von RNA-gesteuerten Nukleasen liefert.

Weitere technische Details finden Sie in der Originalarbeit.

Dieser Artikel stammt aus dem WeChat-Offiziellen Konto „Academic Headline“ (ID: SciTouTiao), Autor: Xia Qiansi, und wird von 36Kr mit Genehmigung veröffentlicht.